Главная – Журналы – Сибирский научный медицинский журнал 2018 номер 6

Каталитический домен белка ядерного включения вируса табачной мозаики TEVp используется для расщепления искусственных слитых полипептидов. Однако получение рекомбинантного фермента имеет определенные трудности из-за низкого выхода продукта и его малой растворимости в физиологических растворах. Цель исследования - оптимизация способов получения рекомбинантного фермента TEVp из клеток-продуцентов Escherichia coli. Материал и методы. Исследования выполняли на клетках E. coli штамм BL21(DE3), продуцентах рекомбинантной протеазы. Фермент синтезировался клетками в виде слитого полипептида с мальтозосвязывающим белком (MBP) с последующим саморасщеплением. Наработку биомассы проводили при различных условиях: изменение температурного режима, времени инкубации клеток с индуктором (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид), концентрации индуктора и фазы роста культуры при добавлении индуктора. Фермент выделяли с помощью аффинной хроматографии в нативных условиях и с увеличенной концентрацией хлорида натрия, его активность проверяли на химерном рекомбинантном аполипопротеине А-I человека (~33,4 кДа). Результаты их обсуждение. Значительное влияние на конечный выход фермента оказывала фаза роста культуры при добавлении индуктора. Оптимальными условиями получения биомассы были найдены следующие: температура инкубации с индуктором 30 °С; время инкубации 4 ч; концентрация индуктора 200 мкМ; оптическая плотность при добавлении индуктора 2,0-2,5 о.е./мл (конец экспоненциальной фазы роста культуры клеток). Концентрация хлорида натрия в буферном растворе при выделении белка составила 150 мМ. Выход фермента в данных условиях достигал 50 мг/л культуры клеток. Во всех случаях полученный фермент сохранял свою активность. Заключение. На выход рекомбинантного фермента из клеток-продуцентов E. coli шт. BL21(DE3) в экспрессирующем векторе pD441-MBP под регуляцией гена бактериофагового промотора «Т5» наибольшее влияние оказывает фаза роста культуры клеток в момент запуска экспрессии гена.

http://sibmed.net/article/645/snmzh_6-2018_ryabchenko_13-18.pdf